INTRODUCTION

INTRODUCTION
Decades of research on tendon and ligament (T/L) injuries have yielded extensive knowledge of the mechanical and biological properties of these dense connective tissues, translating into advances in surgical and conservative therapies that can prevent major disability. However, T/L injuries remain a persistent clinical challenge. In the U.S. alone, tendon, ligament, and joint capsular injuries account for 45% of the 32 million musculoskeletal injuries each year (Butler et al., 2004), with rates rising due to increasing sports participation and an aging population. Unfortunately, current treatment strategies fail to restore the functional, structural, and biochemical properties of repaired T/L to those of native tissue. Consequently, the principal elements of tissue engineering – cells, scaffolds, and bioactive molecules – have been explored in an effort to improve T/L healing. Both in vitro and in vivo studies have expanded the understanding of T/L biology while demonstrating the utility of tissue engineering in enhancing the healing of musculoskeletal tissues. Nevertheless, no tissue engineered construct thus far has achieved complete regeneration of T/L. In response, tissue engineers are looking to the emerging understanding of T/L development in an effort to recapitulate the embryonic events that establish the native structure (Thomopoulos et al., 2010). While researchers are only beginning to explore methods of integrating developmental biology into the design process, such efforts may advance the field of T/L tissue engineering towards its ultimate goal, full restoration of normal mechanical and biological properties (Lenas et al., 2009a). In this review, we will begin with the present understanding of tendon development. Ligament development has not received as much attention as that of tendon, but lessons learned from the latter should be applicable to the former, as tendons and ligaments possess similar ultrastructure and physiology, as well as fulfilling similar functional roles (Tozer and Duprez, 2005). The natural healing cascade of T/L will be summarized, as current therapeutic approaches to the three most common tendon injuries – tears of the rotator cuff, Achilles tendon, and flexor tendon of the hand – will be reviewed. Next, an overview of the current tissue engineering strategies to improve tendon healing, including cells, growth factors, scaffolds, and mechanical stimulation, will be provided. In closing, we will briefly explore the current limitations to tendon and ligament regeneration before offering future directions to address these challenges.
TENDON DEVELOPMENT
Despite the relative simplicity of tendon structure, understanding of tendon development was limited by the absence of a tendon-specific lineage marker. However, identification of several markers selectively associated with tendon and musculoskeletal tissues has made it possible to trace the formation and maturation of tendons (Figure 1A). Scleraxis (Scx), initially discovered as a sclerotome marker (Cserjesi et al., 1995), and subsequently in all muscle-to-bone attachment sites in chick embryos, is expressed in both tendon progenitor cells and mature tenocytes (Schweitzer et al., 2001). Scx binds a short cis-acting element known as tendon specific element 2 (TSE2) to form the Scx/E47 heterodimer, which in turn activates the collagen type Iα1 (COLI a1) proximal promoter (Carlberg et al., 2000; Lejard et al., 2007). The overexpression of Scx in tendon fibroblasts upregulates the expression of the tenomodulin (Tnmd) gene. This latter gene encodes a transmembrane protein that 

 

expressed selectively in tendons and ligaments, and is considered a late marker of tendon formation (Shukunami et al., 2006). In situ hybridization analysis of the somitic mesoderm that forms along the anterior-posterior axis of the developing embryo in segmented animals provided further insight into the origin of tendon progenitors (Brent et al., 2003; Schweitzer et al., 2001). Scx-expressing progenitor cells first appeared between the myotome and sclerotome (Figure 1B-D). The localization pattern indicated that cells expressing Pax1, an early sclerotome marker, occupy a similar somitic domain as that of Scx-expressing cells. However, Pax1 is expressed more ventromedially while Scx is restricted to those cells nearest the myotome. On the other hand, Scx expression does not overlap with MyoD expression in the myotome. Rather, Scx-expressing progenitor cells are seen immediately adjacent to MyoD-positive cells. They constitute a fourth somitic compartment, syndetome, associated with myotome and sclerotome (Figure 1 A-F).
Further resolution of the origin of Scx-expressing tendon progenitors was found by using a chick-quail chimera model. When quail sclerotomal cells were implanted into chick embryos, quail cells generated Scx-expressing progenitors. Conversely, in embryos transplanted with quail dermamyotomes, quail cells did not contribute to the Scx-expressing progenitors. Although cells of the developing muscle-tendon-bone complex occupy distinct spatial regions, the generation of Scx-expressing progenitors requires signals from both the sclerotome and myotome. Overexpression of Pax1 in sclerotome blocked Scx induction, suggesting that Pax1-positive sclerotome is unable to generate the tendon progenitors. Additionally, no induction of Scx was observed in somites with the dermamyotome removed prior to myotome formation, indicating that the myotome plays a critical role in Scx induction.
Fibroblast growth factor 8 (FGF8), secreted by the myotome, is partly responsible for inducing Scx expression through the Ets transcription factors Pea3 and Erm (Brent and Tabin, 2004). It also functions to downregulate Pax1 in Scx-positive domains in the sclerotome, although such repression alone does not result in Scx expression (Brent et al., 2003). Other FGF family members, such as FGF4, were also found to positively regulate induction of tendon progenitors. FGF4 transcripts are located at the extremities of muscles, close to the attachment sites of tendons in the embryonic chick wing, and the overexpression of FGF4 induces ectopic expression of Scx and tenascin in wing buds (Edom-Vovard et al., 2002).
In addition to FGFs, members of the transforming growth factor-β (TGFβ) superfamily are involved in regulating tendon development, as has been found in various species. For example, TGFβ-2/3 ligand and its receptors were detected throughout the tertiary bundles in the tendon midsubstance and endotenon during the intermediate stages of tendon development in the chick embryo (Kuo et al., 2008). During mouse patellar tendon development, all cells in the tendon were found to respond to TGFβ and BMP signaling at all stages examined, including embryonic and postnatal periods (Liu et al., 2012). In vitro micromass culture of chick mesodermal cells with TGFβ demonstrated significant upregulation of tendon markers Scx and Tnmd, with concurrent reduction in cartilage markers. This trend was lost with the addition of a Smad2/3-specific inhibitor, indicating that the tenogenic effect of TGFβ was mediated by the canonical Smad signaling pathway